Новости АССОЦИАЦИЯ Мероприятия Статьи Литература Атрибутика ГистоКлаб

Новости

АССОЦИАЦИЯ

Мероприятия

Статьи

Литература

Атрибутика

ГистоКлаб



8 800 700 92 46
info@histoclub.ru

^ Наверх

Фиксация ткани: обзорная статья
(назад к оглавлению статей)

Фиксация ткани – один из важнейших этапов изготовления гистологического препарата. Смысл этого этапа работы с тканью заключается в том, чтобы зафиксировать ткань в состоянии, максимально близком к прижизненному, и не позволить ей как-либо измениться, чтобы ее исследование имело смысл. Существует множество меодов фиксации, включая микроволновую, низкотемпературную и проч., но в рутинной практике в основном используется химическая фиксация с помощью альдегидных или спиртовых растворов.
В качестве основных требований к фиксирующей жидкости можно перечислить высокую скорость инфильтрации (проникновения в ткань), превышающую скорость аутолиза (распада), минимальное деформирующее воздействие на ткань, и сохранение способности материала воспринимать красители. При этом фиксаторы должны быть химически стабильны и приспособлены для длительного хранения.
Наиболее универсальной фиксирующей жидкостью, в большей или меньшей степени соответствующей всем перечисленным требованиям, является формалин. Ткань, зафиксированная при помощи формалина, без значительных изменений сохраняет свой биохимический состав, и, в том числе, неорганические вещества, что является преимуществом формалин,а по сравнению со спиртами и ацетоном, являющимися более избирательными фиксаторами. Принцип фиксирующего действия формалина основан на формировании метиленовых сшивок между крупными молекулами, содержащими ароматические кольца, амидные, гидроксильные, гуанидиновые, сульфагидрильные группы, аминогруппы и реактивные атомы кислорода. Скреплённые и зафиксированные таким образом пространственные структуры сохраняют способность к адсорбции воды, красителей и т.д.



Как правило, используется 10% нейтральный забуференный формалин, имеющий рН 7.0. Такое значение pH формалина обеспечивают минимальное повреждение тканей и сохраняет их восприимчивость к красителям. Использование раствора 10% является оптимальным, поскольку более низкие концентрации не обеспечивают полной фиксации ткани, а при превышении концентрации 12% эффективность фиксации снижается за счёт уплотнения тканей на поверхности образца, которое не позволяет формалину проникнуть в подлежащие слои.
Необходимостью поддерживать концентрацию фиксирующей жидкости продиктованы и рекомендации по соотношению объёма фиксатора и фиксируемой ткани, составляющему 20:1. В ходе фиксации значительное количество формальдегида покидает раствор, уходя в ткань. Нивелировать эту потерю можно именно благодаря указанному соотношению объёмов.
В усреднённом случае рекомендуется проводить фиксацию 20-24 часа. Плотная консистенция ткани, высокое содержание коллагеновых волокон и другие химические и структурные особенности материала могут сказываться на продолжительности фиксации. При нагревании фиксация ускоряется, однако превышение разумных пределов ведёт к выраженным повреждениям ткани, поэтому рекомендуемое значение составляет 36-40 °С. Вместе с фиксацией ускоряется и аутолиз, следовательно, данному этапу должно предшествовать пребывание материала в фиксирующей жидкости при комнатной температуре не менее 2 часов. Обратное так же верно: при снижении температуры происходит замедление как инфильтрации ткани фиксатором, так и разрушения тканевых элементов, поэтому данный способ актуален в случае необходимости достоверного сохранения особо уязвимых тканевых и клеточных структур. Применение микроволнового излучения – ещё один способ ускорения процесса фиксации, однако такую обработку материала следует производить с использованием специального оборудования, которое позволяет контролировать температуру в камере.
Учитывая, что даже в идеальных условиях глубина эффективной фиксации при помощи формалина колеблется в пределах 8-10 мм, фиксируемый материал не должен выходить за эти пределы хотя бы по одному из измерений, а учитывая стандартизированный размер гистологических кассет, можно говорить о рекомендуемом размере кусочков, составляющем в среднем 20х20х2 мм.
Современные методы исследования требуют сохранения не только морфологической структуры ткани, но и входящих в её состав биомолекул, прежде всего белков и нуклеиновых кислот. Для этого используются такие фиксаторы как жидкость Карнуа и её модифицированный вариант, метакарн, в состав которого вместо этанола входит метанол. Данным требованиям удовлетворяет также методика UMFIX (Universal Molecular Fixative), в основе которой лежит применение фиксатора, содержащего метанол и полиэтиленгликоль, в сочетании с последующей проводкой с использованием микроволнового излучения. UMFIX позволяет получать достоверно лучшие по сравнению с фиксацией в формалине результаты FISH и ПЦР благодаря сохранению нуклеиновых кислот. Эти фиксаторы также обеспечивают высокую сохранность морфологической структуры и антигенного состава ткани.
Особые требования к фиксаторам предъявляются, если исследование требует анализа ультраструктур посредством электронной микроскопии, например в случае с нефробиоптатами. Для сохранения истинного размера и формы компонентов нефрона в качестве фиксатора используется нейтральный глутаральдегид.
Дефекты, допущенные на стадии фиксации, как правило, необратимы и неизбежно сказываются негативным образом на дальнейших этапах вплоть до утраты материалом диагностической значимости, поскольку именно на этом этапе происходит стабилизация тканевых структур и предотвращение аутолиза. Правильное осуществление фиксации и адекватная адаптация протокола при решении специализированных задач важны для получения качественного материала для последующего исследования.

Назад к оглавлению статей
Назад

Яндекс.Метрика